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Daniel Steppich

• In this thesis, the focus will be set on the action of the blood clotting factor Von Willebrand Factor (VWF), which plays a pivotal role during both primary and secondary haemostasis under elevated shear flow conditions. The observation of the necessity for a critical shear stress to mechanically unroll the multimeric protein VWF from a globular into an activated unrolled conformation led to a variety of biologically and medically motivated questions. In particular, the cumulative effect of stream line perturbations in close vicinity to an injured vessel wall and the influence of the surface itself on the critical shear rate were found to significantly affect network formation. Compared to bulk conditions, the combined slowing down of both rotational and translational VWF movement near a planar surface decreases the critical shear rate by up to 60% and hence facilitates VWF activation. Furthermore, modified streaming properties and vortex formation around protruding parts of damagedIn this thesis, the focus will be set on the action of the blood clotting factor Von Willebrand Factor (VWF), which plays a pivotal role during both primary and secondary haemostasis under elevated shear flow conditions. The observation of the necessity for a critical shear stress to mechanically unroll the multimeric protein VWF from a globular into an activated unrolled conformation led to a variety of biologically and medically motivated questions. In particular, the cumulative effect of stream line perturbations in close vicinity to an injured vessel wall and the influence of the surface itself on the critical shear rate were found to significantly affect network formation. Compared to bulk conditions, the combined slowing down of both rotational and translational VWF movement near a planar surface decreases the critical shear rate by up to 60% and hence facilitates VWF activation. Furthermore, modified streaming properties and vortex formation around protruding parts of damaged endothelium or extracellular matrix may directly result in an accumulation of the protein and contribute to an enhanced network formation potential. The elucidation of the interior dynamics of these extended networks represented an exquisite experimental challenge. The development of a Surface Acoustic Wave (SAW) driven microfluidic reactor integrated into an optical accessible Atomic Force Microscope (AFM) was a prerequisite for studying both the dynamics of the network formation process and its response on minute mechanical manipulation with an AFM tip. Application of pulling forces to VWF conglomerates in this effective hybrid system and monitoring their relaxation behaviour enabled the development of a "bundle jamming" model for crosslinked protein fibres emphasizing the role of both memory effects and strong coupling between single molecules inside protein networks. This coupling is described by an interaction potential U. It exactly determines the order of magnitude of the critical shear rates to fit the conditions in our blood vessels. In a series of experiments with varying solvent polarity, strong evidence was given that U is governed by hydrophobic interactions. From a physiological perspective, a prominent parameter for fine-tuning _U and hence VWF's critical shear rate is a change in the pH of the solution. In this respect, it is a spectacular finding that the critical shear rate for unrolling the VWF molecule exhibits a clear maximum at blood pH ~ 7.4 and can be sensitively manipulated by minute pH variations in the range of ±0,2. Any deviation to both acidic and basic pH values results in a distinct decrease of the critical shear rate. Its consequences on the dynamic course of blood clotting are discussed as local changes from pH ~ 7.4 may occur at vessel lesions or stenosis. The origin of VWF's maximal stability against external forces under normal blood conditions is related to its minimal solubility at its effective isoelectric point which seems to be evolutionary adjusted exactly to blood pH. Our hybrid system allowed to establish a phase diagram, which displays VWF's activity as a function of both shear rate and pH. This phase diagram represents the condensed information for the response of VWF under different haemostatic conditions. The investigation of the adhesion process of VWF to artificial phospholipid membranes identified the membrane phase state, membrane defects and domain boundaries as the main contributions for tight bonding and network formation. Atomic Force Microscopy (AFM) imaging under physiological buffer conditions revealed diverse arrangements of both single and activated VWF networks on varying membrane substrates. Advanced tip chemistry further enabled the binding of large multimers onto the AFM cantilever and the determination of extremely high interaction forces in the range of hundreds of pN of VWF with membranes in series of AFM Force Spectroscopy measurements. Both AFM imaging and Force Spectroscopy distinguished a striking influence of the hydrophobic core of the membrane to the interaction potential. The molecular binding mechanism itself seems to be relatively insensitive to VWF conformation while only the total amount of binding sites increases considerably in the activated state. Shear stress on the other hand does not exclusively affect the VWF multimer but also its dimeric building bock. Structural analysis elucidated a pronounced susceptibility of single dimers to hydrodynamic forces. This will be the first report on structural changes inside the molecular basis of VWF upon mechanical forces. Previous results concerning VWF activation will have to be reconsidered on this molecular level as structural changes in its subunit will affect the stability of the whole protein under flow conditions and hence the stretching process itself.…
• Das Blutgerinnungsprotein Von Willebrand Faktor (VWF) spielt eine essentielle Rolle sowohl während der primären als auch sekundären Hämostase. Die Beobachtung der Abhängigkeit der VWF Aktivität vom Scherfluss des umgebenden Mediums führte zu einer Reihe neuer Fragestellungen. Im Speziellen wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von geometrischen Restriktionen und Oberflächen auf die Proteinaktivierung untersucht. Veränderte Strömungsbedingungen und Wirbelbildung tragen zu einer erhöhten Netzwerkbildung bei. Die Untersuchung der inneren Dynamik solcher ausgedehnter VWF Netzwerke stellte eine besondere experimentelle Herausforderung dar. Die Entwicklung eines neuartigen Hybridsystem aus optischer Mikroskopie, Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Oberflächenwellen-getriebener Mikrofluidik war die Voraussetzung zur dynamischen Untersuchung des Netzwerkwerkbildungsprozesses. Mittels mechanischer Manipulation solcher Proteinnetzwerke konnte das Relaxationsspektrum von ProteinbündelnDas Blutgerinnungsprotein Von Willebrand Faktor (VWF) spielt eine essentielle Rolle sowohl während der primären als auch sekundären Hämostase. Die Beobachtung der Abhängigkeit der VWF Aktivität vom Scherfluss des umgebenden Mediums führte zu einer Reihe neuer Fragestellungen. Im Speziellen wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von geometrischen Restriktionen und Oberflächen auf die Proteinaktivierung untersucht. Veränderte Strömungsbedingungen und Wirbelbildung tragen zu einer erhöhten Netzwerkbildung bei. Die Untersuchung der inneren Dynamik solcher ausgedehnter VWF Netzwerke stellte eine besondere experimentelle Herausforderung dar. Die Entwicklung eines neuartigen Hybridsystem aus optischer Mikroskopie, Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Oberflächenwellen-getriebener Mikrofluidik war die Voraussetzung zur dynamischen Untersuchung des Netzwerkwerkbildungsprozesses. Mittels mechanischer Manipulation solcher Proteinnetzwerke konnte das Relaxationsspektrum von Proteinbündeln beleuchtet werden. Daraus wurde ein Proteinmodell ("bundle jamming") entwickelt, das die Rolle von Gedächtniseffekten und einer starken Wechselwirkung von einzelnen VWF Molekülen innerhalb solcher Netzwerke betont. Diese Wechselwirkung wird durch ein Potential U beschrieben, das im Wesentlichen von der Polarität des umgebenden Mediums abhängt. Ein physiologisch relevanter Parameter zur Einstellung des Potentials U ist eine Variation des pH Werts der umgebenden Lösung. Es konnte gezeigt werden, dass selbst minimale Abweichungen des pH Werts vom Blut-pH, wie sie an Verletzungen oder pathlogisch verändertem Gewebe gefunden werden können, einen deutlichen Anstieg in der VWF Aktivierung bewirken. In einem VWF-Phasendiagramm, das die Protein-Aktivität als Funktion der äußeren Scherrate und des pH-Wertes angibt, konnten diese Ergebnisse vereinigt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Wechselwirkung von VWF Molekülen mit künstlichen Zellmembranen bestimmt wird durch den Phasenzustand der Membran, Membrandefekte und Domänengrenzen. Mittels ausgefeilter Spitzenchemie konnten weiterhin VWF Moleküle an AFM Spitzen immobolisiert werden und die Wechselwirkungskräfte im Bereich mehrerer hundert pN zwischen VWF und Membran quantisiert werden. Dabei stellte sich heraus, dass VWF in aktivierter Form eine größere Anzahl von Bindungen mit der Membran eingeht als im inaktiven Zustand.…