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Teresa Maria Neumaier

• Ionising radiation can produce a number of effects in living cells and organisms. One way to investigate its influence on cells is the analysis of microscopically visible nuclear domains, so-called radiation-induced foci (RIF). These foci are protein accumulations, eventually responding to and indicating the presence of DNA double strand breaks (DSBs). RIF have raised much interest as a way to measure DNA damage on a cell-by-cell basis. This work presents a novel experimental approach for RIF quantification in cells by using different chemically modified glass slides. On these slides, cells were cultivated in a volume of V = 5 µl and it was possible to optimise and to accelerate immunostaining of DNA damage markers. Combined with an automated image analysis and biophysical model, this led to a dose response screening of several human cell lines over a wide range of irradiation doses as well as repair times. By including the biophysical kinetic model of foci formation and resolution,Ionising radiation can produce a number of effects in living cells and organisms. One way to investigate its influence on cells is the analysis of microscopically visible nuclear domains, so-called radiation-induced foci (RIF). These foci are protein accumulations, eventually responding to and indicating the presence of DNA double strand breaks (DSBs). RIF have raised much interest as a way to measure DNA damage on a cell-by-cell basis. This work presents a novel experimental approach for RIF quantification in cells by using different chemically modified glass slides. On these slides, cells were cultivated in a volume of V = 5 µl and it was possible to optimise and to accelerate immunostaining of DNA damage markers. Combined with an automated image analysis and biophysical model, this led to a dose response screening of several human cell lines over a wide range of irradiation doses as well as repair times. By including the biophysical kinetic model of foci formation and resolution, the absolute RIF yield at various doses could be evaluated unambiguously. Instead of being constant as it had been assumed previously, we find that 53BP1 and gamma H2AX RIF yield per unit of radiation decreased with irradiation dose. A two- to threefold drop in the number of RIF/mGy/cell from the lowest dose (50 mGy, 150 mGy) to the highest irradiation dose (1000 mGy, 2000 mGy) was deducted from our data. In addition, kinetic constants were also found to be dose dependent, suggesting a faster formation (e.g. 3,5 - 2,2 min for 150 - 2000 mGy) but slower loss of RIF (e.g. 40 min - 2 h for 150 - 2000 mGy) as the dose increased. Overall, these results challenge the concept that one DSB leads to one RIF but suggests instead that multiple DSB in close proximity are likely to cluster into one common repair location. The more DSB per cluster, the faster was the RIF induction but the slower the RIF resolution. More generally, the multi-sample microculture array platform allows for a more detailed but still rapid screening of DNA damage markers and turns out to be a perfect tool for the study of radiosensitivity, DNA repair and the heterogeneity of DNA damage response among populations. Another way to investigate the influence of ionising radiation presented in this work is the evaluation of cell growth experiments under different growth conditions. Experiments with complete and partial irradiation of cells revealed that cells were more affected by the partial irradiation as e.g. observed for the co-cultures of human fibroblasts and HeLa cells. Furthermore, differences in the reaction of cells were observed for different states of confluence in the cell culture. These findings might shed some light on tumor development inside a cellular system and on possible bystander effects that affect neighbouring cells of directly irradiated cells in irradiation tumor therapy.…
• Ionisierende Strahlung kann eine Vielzahl von Effekten bei Zellen und Organismen hervorrufen. Eine Möglichkeit, diese zu untersuchen, ist die Analyse von mikroskopisch sichtbaren kleinen Bereichen, den so genannten strahlungsinduzierten Foci (engl. RIF). Diese Foci sind Proteinanlagerungen, welche möglicherweise auf einen DNS-Doppelstrangbruch (engl. DSB) reagieren bzw. diesen anzeigen. RIF ermöglichen eine Abschätzung von DNS-Schäden auf zellulärer Ebene. Im Rahmen dieser Arbeit wird ein neuartiger experimenteller Ansatz vorgestellt, welcher die Quantifizierung von RIF unter Verwendung von chemisch modifizierten Glasobjektträgern erlaubt. Auf diesen chemisch vorbehandelten Oberflächen wurden Zellen in einem Volumen von V = 5 µl kultiviert, und es war möglich, die Immunofluoreszenzfärbung von DNS-Schäden-Markern zu optimieren und zu beschleunigen. Kombiniert mit einer automatischen Bildanalyse sowie einem biophysikalischen Modell war es dadurch möglich, die Reaktion von mehrerenIonisierende Strahlung kann eine Vielzahl von Effekten bei Zellen und Organismen hervorrufen. Eine Möglichkeit, diese zu untersuchen, ist die Analyse von mikroskopisch sichtbaren kleinen Bereichen, den so genannten strahlungsinduzierten Foci (engl. RIF). Diese Foci sind Proteinanlagerungen, welche möglicherweise auf einen DNS-Doppelstrangbruch (engl. DSB) reagieren bzw. diesen anzeigen. RIF ermöglichen eine Abschätzung von DNS-Schäden auf zellulärer Ebene. Im Rahmen dieser Arbeit wird ein neuartiger experimenteller Ansatz vorgestellt, welcher die Quantifizierung von RIF unter Verwendung von chemisch modifizierten Glasobjektträgern erlaubt. Auf diesen chemisch vorbehandelten Oberflächen wurden Zellen in einem Volumen von V = 5 µl kultiviert, und es war möglich, die Immunofluoreszenzfärbung von DNS-Schäden-Markern zu optimieren und zu beschleunigen. Kombiniert mit einer automatischen Bildanalyse sowie einem biophysikalischen Modell war es dadurch möglich, die Reaktion von mehreren menschlichen Zelllinien über eine Vielzahl von Bestrahlungsdosen und Reparaturzeiten zu klassifizieren. Durch das biophysikalisch kinetische Modell zur Focusbildung und -auflösung konnte die absolute Ausbeute von RIF eindeutig bestimmt werden. Im Gegensatz zu der bisherigen Annahme, dass diese Ausbeute ein konstanter Wert sei, nahmen die Werte sowohl für 53BP1 als auch Gamma H2AX RIF mit steigender Dosis ab. Eine zwei- bis dreifache Reduktion in den Werten für RIF/mGy/Zelle wurde von der niedrigsten Dosis (50 mGy, 150 mGy) zu höchsten Dosis (1000 mGy, 2000 mGy) berechnet. Des Weiteren wurde auch eine Dosisabhängigkeit der kinetischen Konstanten bestimmt, welche eine schnellere Bildung (z.B. 3,5 - 2,2 min für 150 - 2000 mGy), jedoch zugleich langsameres Verschwinden von RIF (z.B. 40 min - 2 h für 150 - 2000 mGy) mit steigender Dosis aufzeigten. Allgemein kann festgehalten werden, dass die Ergebnisse aus den verschiedenen Experimenten die bisherige Annahme, ein DSB entspricht immer einem RIF in Frage stellen. Vielmehr weisen die Ergebnisse darauf hin, dass mehrere DSB in näherer Umgebung zueinander, sich in einem gemeinsamen Reparaturzentrum anlagern. Je mehr DSB pro Cluster zu finden sind, desto schneller kommt es zur RIF-Bildung und desto langsamer zur RIF-Auflösung. Letztlich zeigen die Forschungsergebnisse, dass die Mikrokultur-Arrayplattformen eine genauere und schnellere Analyse von DNS-Schäden-Markern ermöglichen und dass sie somit ein optimales Instrument für die Untersuchung von Strahlungsempfindlichkeit, DNS-Reparatur und Heterogenität der Antwort auf DNS-Schäden innerhalb einer Population darstellen. Eine andere in dieser Arbeit vorgestellte Möglichkeit für die Analyse von strahlungsinduzierten Effekten wird durch Zellwachstumsexperimente für verschiedene Bedingungen aufgezeigt. Experimente mit Komplett- bzw. Teilbestrahlung von Zellen zeigten, dass die teilbestrahlten Zellen zum Teil mehr durch die Strahlung beeinflusst wurden als die komplettbestrahlten Zellen, wie z.B. im Fall von Co-Kulturen bestehend aus menschlichen Fibroblasten und HeLa-Zellen. Des Weiteren wurden Unterschiede im Zellverhalten für verschiedene Konfluenzstadien beobachtet. Durch diese Art von Experimenten wäre es möglich, mehr Erkenntnisse über die Tumorentwicklung zu erhalten sowie mögliche Bystandereffekte in Nachbarzellen von direkt bestrahlten Zellen in der Tumortherapie durch Bestrahlung zu erforschen.…